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作者：
Myron Nevins博士
美国哈佛大学牙科学院口腔医学、感染和免疫学、牙周病学系
Marc L. Nevins博士
美国哈佛大学牙科学院口腔医学、感染和免疫学、牙周病学系
Peter Schupbach博士
瑞士Schupbach公司组织学、显微镜和影像服务与研究
Soo-Woo Kim博士
美国哈佛大学牙科学院口腔医学、感染和免疫学、牙周病学系
Zhao Lin博士
美国哈佛大学牙科学院口腔医学、感染和免疫学、牙周病学系
David M. Kim博士
美国哈佛大学牙科学院口腔医学、感染和免疫学、牙周病学系
如今，人工颗粒骨移植材料受到越来越多患者和临床医生的青睐，但实际上这些人工生物材料的成骨能力有限，提高其骨再生能力对于局部牙槽嵴缺损的治疗具有重要意义。本研究为一项前瞻性随机对照临床前试验，利用6只雌性猎狐犬，分析了不同配方比例的双相磷酸钙（BCP）与羟基磷灰石-胶原膜（HA胶原膜）结合使用的成骨作用，及其修复种植位点骨缺损的能力。移植位点愈合3个月后，用环钻取骨活检进行光镜和组织形态学的定量分析。结果表明，所有移植位点愈合良好，愈合期间无早期膜暴露或软组织不良反应。移植位点比周围天然骨的射线不透性更高，BCP颗粒被视为辐射不透颗粒。移植材料整合良好，未观察到松散颗粒区域。组织学评估显示，BCP颗粒嵌入到具有致密结缔组织/骨髓间隙的网状骨中。在移植物颗粒周围及其结构内部均观察到新骨生长。在测试组的所有活检中，移植颗粒与新形成的骨之间均有紧密接触，并被新骨连接。目前的临床前研究结果表明，BCP移植颗粒具有刺激新骨形成的潜力，该结论需要临床研究进一步证实。
关键词：材料生物活性，局限性牙槽嵴缺损，人工骨材料，双相磷酸钙，羟基磷灰石胶原膜，牙槽嵴增量，成骨作用
治疗局部骨缺损的骨移植替代材料有很多种，人工骨材料可以避免自体骨移植带来的不良反应，也可以避免异种骨移植带来的疾病传播风险。具有成骨能力的人工骨材料是治疗局部骨缺损的理想移植材料。
由羟基磷灰石（HA）和磷酸三钙（β-TCP）组成的双相磷酸钙（BCP）是一种类似于人类骨组织无机相的骨移植替代材料。不溶性HA可以保留其形状和结构以维持空间，而β-TCP将通过溶解成钙和磷离子来刺激新骨形成。已有研究证实，HA /β-TCP比例对于材料的替代率和生物活性有重要影响。一种BCP配方（60% HA和40%β-TCP）已成功用于牙槽嵴增量、上颌窦提升、种植体周围骨裂开和骨开窗的治疗。在6-8个月内，接受上颌窦提升的患者中有28.4%-37.5%观察到了新骨形成。因此，BCP的安全性、生物相容性和生物可吸收性已经得到了证实，可以作为新骨形成的支架，有效促进新骨形成。
本临床前研究为了进一步评估BCP应用于牙槽嵴增量时作为骨引导支架的性能，将不同配方比例的HA /β-TCP移植材料与新型HA胶原膜相结合，应用于标准的下颌大面积牙槽嵴缺损修复。
本前瞻性随机对照临床前试验利用6只雌性猎狐犬，分析不同配方比例的HA /β-TCP移植材料与新型HA胶原膜结合使用时的成骨作用，及其修复种植位点骨缺损的能力。
实验动物和生物材料
本研究方案已获马萨诸塞州PARF动物护理和使用委员会的批准。从具备相应资质的供应商处购买六只实验用雌性猎狐犬（年龄2-3岁，体重20-24公斤），在正式研究开始前驯化2周，适当喂养。
使用三种不同配方的人工BCP和一种屏障膜进行处理，具体分组如下：
• A组（OSTEON™ I，登腾公司，韩国）：70% HA和30% β-TCP（0.5-1.0 mm粒径，孔隙率77%，大孔尺寸300-500 μm，结晶度93%，晶体尺寸0.059 μm）；7个位点。
• B组（OSTEON™ II，登腾公司）：30% HA和70%β-TCP（0.5-1.0 mm粒径，孔隙率70%，大孔尺寸250 μm，结晶度97%，晶体尺寸0.043 μm）；7个位点。
• C组（OSTEON™ II Collagen，登腾公司）：30% HA和70%β-TCP（0.5-1.0 mm粒径，孔隙率70%，大孔尺寸250 μm，结晶度97%，晶体尺寸0.043 μm）和胶原蛋白；人工骨材料与胶原材料的体积含量分别为92%和8%；7个位点。
• D组：阴性对照（不植骨）；3个位点。
• HA- 胶原蛋白交联膜（Genoss公司，韩国）。
全身和局部麻醉
所有外科手术均在全身和局部麻醉后、在无菌条件下进行。首先注射盐酸甲苯噻嗪（2.2 mg/kg，肌肉注射）和盐酸替拉明/盐酸唑拉西泮（10 mg/kg，肌肉注射），然后吸入1.5%-2%异氟醚作为手术期间的全身麻醉。在手术部位进行局部麻醉（含1:100,000肾上腺素的2%利多卡因）。
拔牙和制造骨缺损
拔除双侧下颌先进、第二、第三和第四前磨牙（P1–P4），通过去除颊侧骨板（保留舌侧壁完整）制造双侧标准化牙槽嵴缺损（近远中长度约12 mm，冠根向高度约10 mm）（图1和2）。减张后间断缝合，愈合2个月。
骨增量手术
手术在慢性骨缺损愈合2个月后进行，以避免自发性骨再生。将实验对象随机分配至各组，除阴性对照组（D组，骨缺损）外，每个实验组接受3种不同的骨移植材料（A、B和C组）。在牙槽嵴处切开，翻黏骨膜瓣暴露颏孔，根据随机分布模式在骨缺损处植入移植材料，保证相邻位点的增量材料不同（图3）。每个位点在植入材料后均覆盖HA胶原膜，并用不锈钢钉（登腾公司）固定（图4）。切开黏骨膜瓣的骨膜层进行减张，间断缝合，确保缝合后的伤口无张力。术后进行标准感染和疼痛控制，使用头孢唑啉钠（20 mg/kg，肌肉注射）和盐酸丁丙诺啡（0.02 mg/kg，肌肉注射）。14天后拆线，在整个康复期和治疗阶段均喂软食。
骨活检
术后3个月进行了X线检查并拍摄照片。翻黏骨膜瓣后使用2-4 mm宽的齿环钻（登腾公司）从各手术位点取骨活检，再在被采区域内植入种植体（3.4 mm宽，8-10 mm长，登腾公司），埋入愈合3个月。
光学显微镜观察和组织形态学定量分析
骨在使用乙醇进行梯度脱水（乙醇浓度依次为60%，80%，96%，100%）后，使用单组分光固化复合树脂（Technovit® 7200 VLC，Kulzer公司，德国）将其包埋。进行打磨以使待检组织成分贴近切割面。使用金刚砂盘进行片切，切割压力50-100 g，切片厚度100 μm，使用1200、2400和4000粒度的砂纸进行研磨和精细抛光，最终厚度达到40 μm。对切片进行Sanderson快速骨染色和酸性品红复染后，用Leica M16立体显微镜（Leica Microsystems，瑞士）进行观察和拍照，使用软件（Image Access，Imagic公司，瑞士）进行组织形态测量，以计算矿化骨、软组织成分（结缔组织和/或骨髓）和残余的移植物颗粒的百分比。
统计分析
对所有定量数据进行统计分析，计算平均值和标准差。经Shapiro-Wilk正态性检验，各组数据没有显著偏离正态分布（各组P > 0.05）。因此，采用单因素方差分析（ANOVA）和图基事后检验法进行两两比较，显著性水平P < 0.05。
临床和影像学评估
在愈合期间未观察到早期膜暴露或不良软组织反应。移植部位显示出比天然骨周围更高的射线不透性（radiopacity），BCP颗粒表现为阻射性。移植材料整合良好，未观察到松散颗粒的区域。
所有3组均观察到移植材料整合，但由于可见残留的移植物颗粒，一些移植部位与周围的宿主骨仍可区分（图5）。阴性对照组的骨缺损显示出最小的骨再生和凹嵴形态。所有3个移植部位（A组- C组）的牙槽嵴轮廓显示稳定，可以接受种植体植入，移植区和自体骨之间没有明显界限。
从24个治疗位点共获得24个活检骨，并植入24颗种植体，初期稳定性良好（图6）。
组织学评估
由于染色和形态的差异，在各实验组中均可以明显区分残余的移植物颗粒与天然骨和结缔组织（图7a至9c）。BCP颗粒嵌入到具有致密结缔组织/骨髓间隙的网状骨中。在移植物颗粒周围以及移植物颗粒结构内均观察到新骨生长（图9b）。在测试组的所有活检中，移植颗粒与新形成的骨之间均有紧密接触、并被新骨连接（图7b、8b和9b）。使用背散射扫描电子显微镜观察抛光后的切片可以区分移植材料与新骨组织，前者的颜色更浅、排列更致密（图7c、8c和9c）。
在一些颗粒周围可以看到成骨细胞边缘的存在，这些成骨细胞处于活跃的骨沉积状态。成骨细胞排列在移植材料颗粒周围沉积的骨样基质层中（图8b）。在所有3组中均可以观察到骨重建，表现为破骨细胞样多核巨细胞排列在再吸收的移植材料颗粒周围。从组织学标本中无法清楚地确定骨形成或吸收的比率。
组织形态学定量分析显示，所有组均有大量新骨形成（图10）。各组的活骨平均百分比为：A组41.0% ± 10.0%、B组46.6% ± 5.5%、C组49.3% ± 10.9%、D组为54.1% ± 8.8%。A组、B组和C组的剩余移植物颗粒平均百分比分别为23.9% ± 2.1%、10.4% ± 2.0%和12.9% ± 9.6%。3个实验组之间的活骨平均百分比无统计学差异，但剩余移植物颗粒平均百分比的差异有统计学意义（P = 0.02，ANOVA）。与A组和C组相比，B组剩余移植物颗粒量要少，但只与A之间的差异具有统计学意义（P = 0.022，图基检验）。综上所述，所有骨缺损最终愈合后骨量相近，但移植材料中具有高比例HA成分的A组（比例为70%，B组和C组为30%）的材料吸收速度更慢。
本研究对3种BCP人工骨替代材料在修复大面积下颌骨缺损时的成骨能力进行了临床、影像学、组织学的比较和形态学定量分析。
据既往研究报道，A组BCP材料（70% HA和30%β– TCP）可应用于上颌窦提升，而B组 BCP材料（30% HA和70%β– TCP）可应用于牙槽嵴增量。愈合3个月后，所有21个移植位点（A组– C组）的牙槽嵴尺寸均保持稳定，可以满足种植需要。
目前，有一些研究认为BCP可以应用于多种颌面部疾病治疗。这些材料必须具有生物相容性和生物降解性，从而有利于形成新骨。多孔性和骨间活性会影响材料的生物降解速率、骨形成、血管化和材料稳定性。有研究表明，β–TCP的降解速率是HA的3–12倍，因此BCP中β–TCP的比例越大，材料的吸收速度越快，有利于新骨形成。因此，当稳定的HA成分与易吸收的β–TCP的比例理想时，将有利于促进新骨形成。
在大多数组织学样本中均可以观察到骨再生，同时也可以看到残留的移植材料，但后者并没有干扰牙槽嵴的重建过程。这可能与临床结果相关。在所有移植位点均可以观察到移植材料的逐渐吸收，并被新骨替代。成骨细胞可以直接在BCP表面形成新骨，但BCP被吸收的机制目前尚不明确。以往曾有研究报道BCP会发生表面崩解或碎裂成细小颗粒，另一些研究认为破骨细胞在材料吸收的过程中发挥了作用。移植位点的新骨比例很高，这表明骨细胞替代BCP的过程很活跃，如果延长观察时间，新骨可能会进一步增加，而剩余移植材料则会继续减少。在另一篇论文中将对本研究种植体植入后的实验结果进行阐述。
Jensen等人比较了HA /β–TCP比例分别为20 / 80、60 / 40和80 / 20的3种BCP人工骨材料与自体骨修复小型猪下颌骨大面积缺损时的效果，研究发现，比例为20 / 80的BCP人工骨材料与自体骨在各个时间点的骨形成量、骨质量、移植材料吸收率均无显著差异。自体骨和BCP 20 / 80的吸收率较高，而BCP 80 / 20和BCP 60 / 40的吸收率较低。有研究比较了HA /β–TCP比例分别为15 / 85和85 / 15时修复犬下颌骨缺损的效果，通过比较新骨形成和材料吸收率发现，HA /β–TCP比例为15 / 85时新骨形成更早、更多。本研究发现，所有3个实验组均具有相似的骨形成量，但B组剩余骨材料的数量显著低于A组（P = 0.022，图基检验）。因此，BCP中β–TCP的比例越高，术后3个月的移植材料残留量越少。
骨替代材料与屏障膜结合使用的研究报道众多，但本研究先进次联合使用BCP和HA胶原膜修复大面积牙槽嵴缺损。胶原膜中加入HA有利于维持空间，并有可能对矿化过程有促进作用。胶原膜中裸露的HA成分可以诱导骨形成，而胶原成分一般在6–8周后被吸收。尽管胶原膜有利于移植材料的固定和塑形，但本研究无法判断其是否有助于骨形成。如果在胶原膜下方不放置移植材料，柔软的胶原膜则无法维持修复骨缺损所需要的空间。
HA /β–TCP复合物具有良好的生物相容性和骨传导性，在临床和组织学上均能成功形成骨。临床和组织学证据表明，本实验所采用的3种比例的BCP均适用于治疗大面积牙槽嵴缺损，术后愈合3个月即可满足种植需要。
作者声明与本研究相关无利益冲突。本研究由登腾和Genoss公司提供基金赞助。
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