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作者：
Carlo Maria Soardi博士（意）
布雷西亚私人牙科诊所
Francesco Cavani硕士（意）
摩德纳和雷焦埃米利亚大学生物医学、代谢和神经科学系
Barbara Soardi博士（意）
布雷西亚私人牙科诊所
Davide Zaffe硕士（意）
摩德纳和雷焦埃米利亚大学生物医学、代谢和神经科学系
王鸿烈博士（美）
密歇根大学牙科学院牙周病学和口腔医学系
本研究对使用猪源磷灰石异种移植物在重度萎缩的牙槽嵴进行上颌窦底提升术的结果进行了临床和组织学评估。在24名剩余骨高度≤2 mm患者中，采用两阶段牙槽嵴顶开窗上颌窦底提升术。将高孔隙度的猪源碳酸盐磷灰石用生理盐水湿润后，作为唯一的移植材料放置在提升后的窦腔内。术后6、9和12个月（种植体植入时）取骨活检样本。采用Micro-CT和组织学分析评估治疗结果。统计分析采用非参数性Kruskal-Wallis检验，随后进行事后Dunn多重比较检验。在种植体植入后的6个月，所有种植体都达到良好的初期稳定性（植入扭矩≥30 Ncm）并成功骨结合。6个月时残留移植物量（均值±标准误）较低（11.91%±1.99%），12个月时进一步减少（6.11%±2.64%）。相反，检测到的新骨量在6个月时为18.94%±4.08%，并且在12个月时显著增加（40.16%±5.27%）（P<0.05）。组织学评估显示骨吸收细胞活跃地吸收移植物，骨母细胞活跃地形成新骨。在重度骨质不良的上颌部，猪源磷灰石异种移植物在缓慢吸收的同时促进了新骨形成。在有限的样本量内，猪源磷灰石异种移植物似乎是进行牙槽嵴开窗上颌窦底提升术的良好移植材料。
关键词：猪源磷灰石、异种移植物、上颌窦底提升术
不足的骨量是影响牙种植术效果的主要问题之一。上颌窦底提升术的主要目标是通过形成有活力的骨以提供充足的骨量。侧壁开窗和经牙槽顶提升术是提升上颌窦底的常见方法。理想的方法是使用能够获得可预测结果且术后并发症率低的移植材料。目前已经提出了几种用于上颌窦底提升手术的植骨材料，然而尚需确定哪种移植材料在临床上最适用于上颌窦底骨再生。
自体骨长期以来一直被认为是上颌窦骨增量手术的金标准。但是，它也存在一些缺点，比如在口腔内的可用性有限，易受到显著吸收的影响，需要额外的手术和取材部位。异种移植物的安全性和可预测的临床效果使其成为上颌窦骨移植的理想选择之一。然而，与疾病的潜在关联以及被机体吸收不完全的可能性也使人往往有合理的担忧。
尽管罕见（发病率3%），上颌窦底提升和植骨手术后可能出现上颌窦炎和/或移植材料感染的并发症。上颌窦膜穿孔可能导致移植材料和/或牙种植体脱位进入窦腔，并使材料受到污染，引发异物反应和感染。
所有这些观察结果表明，人们希望找到一种可以像自体移植物一样行为的生物材料，而无需进行移植物获取手术。最近为此目的开发了一种含有高多孔性的猪碳酸盐磷灰石的新型移植材料。该材料是一种基于磷酸钙的矿物质，具有类似于天然骨骼的碳酸盐磷灰石结构，同时结合了来自牛跟腱的5%牛I型胶原蛋白。该材料通过两步高温（烧结）工艺进行处理，以保护免受细菌、病毒和朊病毒的侵害。这种移植材料的高度多孔的结构促进了毛细血管的生长，为骨组织形成所需的营养物质、细胞和生长因子的供应提供了足够的支持。此外，它还能促进成骨细胞增殖，从而加速移植区域的血管化。不仅如此，与自体骨相比，猪碳酸盐磷灰石骨移植物不需要额外的供体部位。该材料的另一个优点是在被适时吸收的同时，能够保持骨组织形成所需的空间，而不引起异物反应。
因此，本研究的目的是在上颌窦底提升手术后的6、9和12个月，对这种新开发的猪骨灰石异种移植物进行临床和组织学评估。
实验设计
本研究是一项临床、组织学和形态学的前瞻性病例系列调查，根据EQUATOR的指南报告（https://www.equator-network.org/reporting-guidelines/strobe/）进行了报告。所有程序严格遵守2013年修订的《赫尔辛基宣言》关于人体研究的建议。
根据意大利法律，与公共和私立医疗中心相反，私人牙科诊所中进行的临床研究既无需考虑也无需提供任何形式的伦理委员会批准。招募的患者签署了详细说明研究所有程序的知情同意书。
从2018年9月至2019年9月，所有病例由一名单一操作员（C.M.S.）在私人牙科诊所中进行处理。
患者选择
招募需要单侧上颌窦底提升的牙列缺损或牙列缺失患者。本研究的纳入标准如下：上颌窦底的骨嵴高度≤2 mm（根据CBCT的连续切片测量）（见图1a），良好的身体健康状况，非吸烟者，无影响骨代谢或伤口愈合的疾病或药物，上颌窦内无特定疾病或问题，并且治疗前3个月内没有定期用药。
每位患者都进行了术前全景X线片和CBCT扫描（Planmeca ProMax 3D），按1 mm递增的深度间隔（图1a）对上颌骨进行了扫描。根据修复计划，根据植入体安置位置，评估了CBCT影像中上颌窦的宽度。使用诊断模板（放射性不透明材料）确定矢状CBCT切片。使用放射学软件（3 Diagnosis 3.0,3DIEMME），测量了距离剩余骨嵴顶向头部至少10 mm处的顶部和冠部骨壁之间的距离（作为参考），以便在6或9个月后放置长度≥10 mm的植入体。此外，还测量了从腭侧到颊侧骨壁的窦骨宽度（PBD）。
手术
上颌窦底提升和术后护理的操作如先前所述（图1）。
手术部位进行局部麻醉（盐酸阿替卡因，Ultracain，Sanofi Aventis公司）。根据术前CBCT，翻开全层厚瓣以显示上颌牙槽嵴（图1b）。使用超声骨刀设备（Mectron）进行牙槽嵴骨窗切开术（图1c）。创建牙槽嵴骨窗后，首先使用超声骨刀，然后使用宽平面刮匙轻轻提升窦膜。
使用含盐溶液湿润的高多孔猪碳酸钙颗粒（颗粒大小为0.25至1.0 mm；RegenerOss®可吸收异种移植物，ZimVie公司）作为移植材料。根据窦腔解剖学和种植体数量，最多可在每个窦底轻轻填充4 g的移植材料（图1d）。在软组织闭合之前，放置可吸收胶原膜（BioMend®，ZimVie公司）覆盖在移植物上，并使用外科Gore-Tex 5/0（W. L. Gore）缝合重新定位唇侧瓣（图1e）。
手术后，患者被建议服用阿莫西林（Ratiopharm）1 g每天两次，持续6到7天，并根据需要使用止痛药（Synflex Forte 550 mg，Recordati公司）。指导患者每天使用0.12%的氯己定漱口水，并在两周内避免刷手术部位。手术后12至14天拆线。
患者在上颌窦底提升术后6至9个月返回进行CBCT拍摄（图1f）和种植体植入手术。种植体植入手术的时间安排是根据招募编号确定的，奇数为6个月，偶数为9个月。手术时，使用肾上腺素浓度为1:100,000的局部麻醉药进行局部浸润（Ultracain）。牙槽嵴顶略微偏腭侧进行全层厚度切口，翻起出一个颊侧全层厚度的粘骨膜瓣，以显示剩余的牙槽骨骨嵴（图1g）。种植体的直径和长度基于CBCT观察到的骨增量结果以及未来修复的修复位置。因此，放置了直径为4.1 mm或4.7 mm且长度≥10 mm的植入体（Tapered Screw Vent® Implant，ZimVie公司；表1）。在进行植入体插入之前，使用盐水冲洗，在600 rpm下使用4 mm外径（3 mm内径）或3.2 mm外径（2.3 mm内径）的钻头（Stroma）采集骨芯标本（长达10 mm）（图1h和1i）。应用骨嵴顶开窗技术仅允许采集由再生骨构成且不含有原生骨的骨芯活检标本（图1j）。骨芯标本的采集是根据个体的修复需求使用手术导板辅助完成的。图1k和1l显示了种植体的植入和术后立即进行的CBCT。
显微CT和组织学
采集的骨芯样本在其嵴骨方面以墨水进行标记，并立即在0.1 M磷酸盐缓冲液（pH 7.2）中的4%福尔马林（Fluka，Sigma-Aldrich公司，瑞士）中室温下固定4小时。样本经缓冲液洗涤，通过乙醇系列脱水，然后在4 °C下无需脱钙，嵌入聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）树脂（Sigma-Aldrich）中。
嵌入PMMA的活检标本在商用柜式锥形束显微CT（μCT 100，SCANCO Medical公司）上进行离体扫描。显微CT检查是无损的，样本在之后仍可供其他检查技术使用。该技术使用来自5 μm焦点的X射线管的锥形束。光子由基于电荷耦合器件传感器的面积探测器检测，并将投影数据计算机重建成一个1890×1890的图像矩阵。
扫描时使用70 kVp，14 μA的钨靶。样本以8 μm的体素大小进行扫描，曝光时间为500毫秒。使用3D约束高斯滤波器对测量数据进行平滑处理，以部分减少噪声，滤波器支持有限（1个体素）和滤波器宽度（σ=0.7）。然后使用全局阈值算法对图像进行分割，将骨骼和移植物与背景分开。
随后，使用金刚石锯微型切片机（Leica SP 1600），沿着骨芯活检的中心对嵌入PMMA的骨样本进行纵向切割。然后，通过骨微切片机（Autocut 1150-Reichert-Jung）获得5 μm厚的组织学切片。接下来，使用甲苯胺蓝或Gomori三色染色法对骨切片进行染色。染色切片在连接到数码相机（DSC 295 m，Leica公司）的透射光显微镜（Leica DM 2500）下进行分析，并获得数字图像。
统计分析
统计分析是使用生物统计学的基本原理进行的。使用非参数的Kruskal-Wallis检验进行比较，然后进行事后Dunn多重比较检验。使用简单线性回归分析趋势。当显著性水平P<0.05时，假设H0被拒绝。
手术
共有24名患者（13名女性，11名男性），年龄在45至80岁之间（平均± 标准差：60.4±8.3岁），需要上颌窦底提升以延期植入种植体，满足所有要求并参与了本研究。所有窦底植骨的位点达到了>10 mm的垂直向高度，以容纳长度 ≥ 10 mm的种植体，并且达到了足够的骨宽（PBD距离范围从6.9至25.1 mm），以允许使用4.1或4.7 mm直径的种植体。
共植入了24颗种植体，每位患者植入一颗，无需进行额外的植骨手术（见表1）。所有种植体都是按照修复导向的位置进行植入，并具有理想初期稳定性（植入扭矩≥30 Ncm）。在植骨手术或骨髓采集和种植体放置后，未报告任何不良事件或异物反应。
种植体植入的时间表原计划在上颌窦底提升术后的6或9个月进行，但由于SARS-CoV-2大流行的中断，部分患者的时间表需要调整（在上颌窦底提升手术后最多385天）。因此，增设了一个12月组。于是，根据植骨和种植体植入之间的时间差，样本被分为三组：6个月（n = 13）、9个月（n = 7）和12个月（n=4）（见表1）。
显微CT和组织学
在植骨后的6到12个月，活检结果显示由猪骨矿物质颗粒、新生的松质骨小梁和软组织组成的复合物（图2至4）。一些植骨颗粒与新生骨没有直接接触，但大部分植骨颗粒与新生骨有密切接触（见图2至4）。在一些骨髓活检的部分区域，可观察到骨髓基质附近的破骨细胞，表明植骨颗粒正在主动吸收。骨小梁的中心部分通常由编织骨构成，这是由于“静态成骨”过程，在相同的位置将静止的成骨细胞转化为骨细胞，这是开始骨内膜骨化/骨形成的关键步骤（见图4）。一些骨小梁具有骨的板层状结构，尤其是在其外表面由成骨细胞形成。
组织形态测定法
组织形态计量学分析（图5）显示，残留植骨颗粒的数量（平均±标准误）分别为11.91%±1.99%、7.28%±2.72%和6.11%±2.64%，在6个月、9个月和12个月后，差异无统计学意义。骨的数量（平均±标准误）分别为18.94%±4.08%、30.1%±4.21%和40.16%±5.27%，在6个月、9个月和12个月后。经过Kruskal-Wallis和Dunn检验后，只有12个月与6个月之间的比较具有统计学意义（P<0.05）。软组织的数量（平均±标准误）分别为69.14%±2.85%、62.37%±3.43%和53.72%±4.3%，在6个月、9个月和12个月后。同样，在Kruskal-Wallis和Dunn检验后，只有12个月与6个月之间的比较具有统计学意义（P<0.05）。
随着植骨和种植体植入之间的时间增加，残留植骨材料和软组织的数量减少（图6）。在这些中，软组织的斜率较高（B=0.08），达到了统计学意义（P=0.02），而残留植骨的斜率较小（B=0.038），仅显示出边际显著的趋势（P=0.09）。相反，新生骨的数量在12个月内增加，并具有最大的斜率（B=0.118），具有统计学意义（P=0.01）。
上颌窦底提升术是预修复手术中最可靠的程序之一。植骨后生物材料的命运取决于以下两个过程：宿主对生物材料的反应和植骨在宿主中的行为。
自体骨被认为是较好的植骨材料之一，即使存在以下主要问题：与供体部位的不良病变相关，以及获取材料所需的额外成本和时间，以及可能需要全麻甚至住院（供体部位位于口腔外部的情况）。
植骨材料的吸收和随后的再气化被认为是选择非可吸收或缓慢可吸收生物材料进行上颌窦底提升术的主要原因。然而，寻找这种替代材料的挑战在于在不引起长期异物反应的情况下找到一个能够长时间保持空间以促进骨形成的非可吸收材料或缓慢可吸收材料。一项荟萃分析和Cochrane综述均得出结论，对于上颌窦底提升手术，骨替代品可以与自体骨一样有效。在本研究中，猪骨磷灰石异种植骨材料克服了传统异种植骨材料的挑战，在作为唯一的上颌窦底提升材料时促进了新骨形成，同时缓慢吸收。从在上颌窦底提升术后6、9和12个月进行的24个样本的结果清楚地表明，植入的猪骨磷灰石异种植骨材料在植骨后6个月时被吸收到约10%左右，而在植骨后12个月平均吸收到6.11%，新形成的骨结构没有明显下陷。此外，数据显示随着时间的推移，新形成骨的数量呈线性增加（手术后6个月为18.94%，12个月为40.16%）。在临床上，通过种植植入时达到的初期稳定性（至少30 Ncm的植入扭矩）进一步验证了猪磷灰石异种植骨材料后的新形成骨。如图2c所示，这导致残余骨移植物数量较少，新骨形成量较大，这表明猪骨磷灰石植骨材料是上颌窦底提升的良好生物材料。虽然一些形成的骨是多孔的，但只要种植体的初步稳定性达到，就如当前研究所述，那么种植体应该能够顺利植入。相反，如果无法达到种植体的稳定性，临床医生建议要么等待骨骼成熟的时间更长，要么根据需要添加更多的植骨材料。
猪磷灰石异种植骨材料的高度多孔结构促进了毛细血管侵入和骨母细胞的迁移和增殖，导致移植区域的血管化加速。此外，猪碳酸盐磷灰石材料克服了额外供体部位的需求（与自体骨相比）的需要，同时保持了骨形成所需的空间，并及时吸收，而不会产生长期的异物反应。所有这些特性表明，当用于上颌窦提升术时，猪骨矿物质脱屑植骨材料是自体骨植骨材料的理想替代品。
异种植骨的经典局限性仍然存在（缺乏成骨特性和活细胞，与自体骨相比，植骨较困难），但在这些研究中，甚至没有迹象显示出最低程度的不良反应。然而，由于生物材料的起源，由于宗教原因或饮食限制的原因，对异体移植的排斥是无法克服的。
该研究的另一个局限性是缺乏适当的对照组（例如其他类型的异种植骨），但作者的目标是在进行比较研究之前，进行这项研究以了解该材料的特性和行为。此外，需要更长时间的随访以观察材料的长期表现。还可能争议的是，个体之间在生物学性别和使用的植骨材料数量方面的差异可能会产生偏差，尽管患者是根据顺序录取而被分配的，以避免任何潜在的偏差。尽管如此，对该研究所得结果应谨慎解释。
在有限的样本量范围内，猪骨磷灰石异种植骨材料似乎是一种用于牙槽嵴及窗上颌窦底提升术的良好植骨材料。猪骨磷灰石异种植骨材料不仅促进新骨形成，而且吸收缓慢，具备许多上颌窦植骨材料的良好特性。但未来需要更大样本量和适当的对照组的研究来进一步验证本研究中所观察到的结果。
这项研究是自费进行的。作者感谢Markus Burkhart（SCANCO Medical公司）的宝贵合作。Carlo M. Soardi博士和王鸿烈博士偶尔因为代表ZimVie/Biomet 3i公司演讲而获得酬金。其他共同作者声明在本报告的出版方面没有利益冲突。
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