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作者：
庄泓敏
南方医科大学南方医院口腔科
广州市中西医结合医院口腔科
庄泓敏和梁悦娥对此项工作做出了等量贡献
梁悦娥
南方医科大学南方医院口腔科
向绍雯
南方医科大学口腔医院
李焕影
南方医科大学南方医院口腔科
戴杏竹
南方医科大学南方医院口腔科
赵望泓
南方医科大学南方医院口腔科
牙本质过敏症（DH）是最常见的慢性疾病之一，其特征是由外部刺激引起的短暂、尖锐的牙齿疼痛，这些刺激包括热刺激、蒸发刺激、机械刺激、渗透刺激和化学刺激。DH引起的不适不能归因于任何其他牙体缺损或病理改变。根据Spleth和Tachou等人的研究（2013），3%-98%的人受到DH的影响，DH会在饮食甚至呼吸过程中引起不同程度的刺激。
尽管DH的发生机制仍然存在争议，但目前流体动力学理论是最被接受的解释。这表明，对DH患牙的外部刺激会导致牙本质小管（DTs）内的液体移动，这会位于牙髓-牙本质界面的神经末梢，最终导致疼痛和不适。根据流体力学理论，缩窄或封闭DT以很大限度地减少牙本质渗透性并降低牙髓敏感性阈值是一种潜在的止痛策略。常用的脱敏剂可分为四类：抗炎剂（皮质类固醇）、蛋白质沉淀剂（甲醛、硝酸银、六水合氯化锶）、小管阻塞剂（氢氧化钙、硝酸钾、氟化钠）和小管封闭剂（树脂和粘合剂）。然而，上述制剂的有效维持时间均不长，内部和外部酸的磨损和侵蚀会导致DT随着时间的推移再次暴露。
激光治疗的出现为DH治疗提供了一种新的选择。目前用于此目的的激光器包括Nd:YAG激光器、Er:YAG激光器，Er，Cr:YSGG激光器、二氧化碳激光器和二极管激光器。其中，波长为2940 nm的Er:YAG激光器的水吸收率很高，预计可以很大限度地减少对牙髓和牙本质组织的热损伤。Walsh和Cummings（1994）发现，Er:YAG激光的吸水率分别是CO2和Nd:YAG激光器的15倍和10000倍。因此，与其他商用激光器相比，Er:YAG激光器具有较高的吸水峰值，在1997年获得美国食品和药物管理局批准后，它在口腔疾病的临床治疗中越来越受到欢迎。在治疗DH的临床实践中，由于设置的差异，不同品牌的参数有所不同（表1）。然而，很少有研究评估Er:YAG激光器在DH治疗方面的很好参数。
本研究假设具有很好参数的Er:YAG激光可以通过封闭DT有效治疗DH，并且对牙髓没有损伤。因此，本体外研究的目的是探索Er:YAG激光用于牙本质小管封闭时的参数，为DH的临床治疗提供依据。因此，本研究观察了这下参数下激光照射对牙髓内温度变化的影响，并观察了成牙本质细胞和牙髓组织的形态学变化，以确定Er:YAG激光治疗DH的安全性。
研究设计
本研究为体外研究，研究方案（图1）已通过医院伦理审查委员会审查和批准，备案号为NFEC-201701-K1-01。
牙本质样本制备
取拔除的20-25岁成年人的第三磨牙，在放大镜下（放大倍数×20）下进行彻底清洁和检查，去除有裂纹、龋齿和修复体的患牙。最终纳入36颗磨牙。使用高速金刚石车针（Mani Inc.，日本），在水冷条件下，从所有36颗牙齿中制备厚度为2 mm、面积为3×3 mm2的牙本质样本（Dentin specimens,DS）。在平行于咬合面的方向上，去除中央窝下方2mm的牙釉质、暴露牙本质。对于均匀的牙本质表面，使用200、600和800粒度的碳化硅纸（SUISUN Ltd.，香港，中国）对试样进行抛光，然后用大量蒸馏水清洗，贮存于0.2%百里酚（志远有限公司，天津，中国）水溶液中直至使用，保存时间不超过1周。在实验之前，将所有样品用35%磷酸（3M ESPE，St Louis，MN，美国）处理1分钟，以暴露牙本质。
Er:YAG激光处理
牙本质暴露后，将牙齿分为六组、每组六颗（根据随机数表）。A组（对照组）在35%磷酸处理后不再进一步的处理。在B组中，使用棉粒轻轻涂抹Gluma脱敏剂（GD；Heraeus，德国），静置60秒后干燥，直至牙本质表面失去光泽，随后用蒸馏水冲洗，上述程序进行两次。C-F组中的样品在以下参数组下接受波长为2490nm的LiteTouch™ Er:YAG激光（LiteTouch™，Syneron Medical Ltd.，以色列）照射：C组，0.5W，167J/cm 2（50mJ，10Hz）；D组，1 W，334 J/cm2（50 mJ，20 Hz）；E组，2 W，668 J/cm2（100 mJ，20 Hz）；和F组，4 W，1336 J/cm2（200 mJ，20 Hz）。所有组别的其他条件保持不变（表2）。激光能量通过磁珠高级（绿色O形环；长度：6.3mm，直径：1.3mm）传递，放置在距离样本1cm处，在1级水喷雾下持续30秒。在照射期间，高级以约1mm/s的速度近远中向移动，样品的照射面积为3×3mm2。所有照射程序均由一名研究人员进行，以确保以最小的变化处理整个牙本质表面。
SEM观察
将处理后的试样在室温下固定在2.5%戊二醛（Phygene Com.，Fuzhou，China）中24小时，用0.1M磷酸盐缓冲液冲洗以去除戊二醛，并风干。乙醇溶液梯度脱水（志远有限公司，天津，中国）（30%、50%、70%、80%、95%、100%；各15分钟），喷金，在扫描电子显微镜（S-4800 SEM，Hitachi Ltd., Hitachinaka，日本）1500倍和5000倍放大倍数下观察。
通过软件（Image Pro PLUS 6.0，Media Cybernetics，USA）测量经扫描电子显微镜（SEM）观察到的开放或部分封闭的DT的面积。在像素灰度值差异的基础上，该软件可以通过绘制这些DTs的轮廓来进行区分，从而便于计算开放或部分封闭的DT的面积。随后使用以下公式计算各组的小管暴露率：
暴露率=开放或部分封闭的DTs的平均总面积÷平均总面积
髓腔内温度测量
在之前的实验中，使用参数为0.5 W，167 J/cm2（50 mJ，10 Hz）的激光处理的牙齿样本的表面显示出最理想的结构变化，没有微裂纹和碳化，因此选择这些参数进行后续实验。选取12颗新鲜拔除的第三磨牙制备样本，并用0.5W，167J/cm2（50mJ，10Hz）的参数进行处理。
在处理之前，在平行于咬合面的方向上去除牙釉质、深达中央窝下方2mm处，从而使牙本质刚好暴露出来。使用金刚砂车针在牙本质中心标记3×3mm2的照射区域。在釉牙本质界下方打孔、直径1mm，以形成用于将K型热电偶（直径1mm）插入牙髓室的通道。将K型热电偶连接至数字温度计（DT-610B，CEM，中国）。将导热糊（Taoxin Com.,深圳市，中国）引入髓室，以确保热电偶高级和室顶之间的良好接触（图2）。这种导热糊的热导率与牙髓的热导率相似。使用玻璃离子水门汀（GC Fuji IX，东京，日本）封闭根尖。在插入导热糊和热电偶后，用蜡密封牙颈部制备的小孔。
在有（G组；n=6）和无（H组；n=6）空气和水冷却的条件下进行照射，而其他条件与先前描述的条件保持相同。通过计算记录值和初始温度值之间的差异，以5或10s的间隔记录照射期间的温度变化。
牙髓组织的形态学改变
选择12颗健康的人第三磨牙去除冠部釉质、暴露下方牙本质，制备得到12个牙本质标本。将其随机分为2组，分别为激光组（A组，0.5W，167J/cm2）和对照组（B组）。根据之前的研究结果，激光组使用0.5 W，167 J/cm2的参数进行处理，对照组不进行任何处理。之后纵向切割以获取牙髓组织，HE（苏木精-伊红）染色后，使用光学显微镜（Olympus BX51；Olympas Optical Co.，Ltd.，东京，日本）对牙髓组织进行形态学观察。
统计分析
所有收集数据均使用SPSS 23.0版（SPSS Inc.,芝加哥市,伊利诺伊州,美国）进行统计分析。使用Kruskal–Wallis检验进行多组间比较。当该测试呈现显著差异时，使用多重（双重）比较Mann–Whitney U测试。p值<0.05被认为具有统计学意义。
SEM观察
对照组的SEM图像显示，许多暴露的DT相互平行、没有堵塞的碎片（图3:A，a）。Gluma脱敏剂组的SEM图像显示，沉淀剂堵塞了一些DT，其中一些DT部分堵塞（图3:B，b）。在C组（0.5W，167J/cm 2）中，可观察到覆盖表面牙本质表面的厚而光滑的熔融层（图3:C，c），该层结构几乎完全覆盖了DT。在D组（1W，334J/cm2）中，牙本质表面似乎随着气泡的形成而熔化，并且观察到一些部分堵塞的DT（图3:D，d）。其他两组（E组和F组）使用了更强功率的激光处理，显示出非常相似的鳞状表面，具有不同深度的开放小管（图3:E，e，F，f）。
图4所示为组间暴露率的比较。6组间差异有统计学意义（P<0.001），Gluma脱敏治疗组（B组）小管暴露率显着低于对照组（P<0.05），但其暴露率仍高于C组和D组（P<0.05），激光组C组暴露率（0.0002±0.0002）明显低于其他各组（P<0.05），随着功率的增加，暴露率明显增加（P<0.05）。
髓腔内温度测定
在前面实验中，C组获得的结果最为理想，因此接下来使用0.5W、167J/cm2的照射参数进行髓腔内温度测定。图4显示了在0.5W、167J/cm 2的Er:YAG激光照射期间髓腔内温度测量的结果。在有空气和水冷却的条件下，最终温度低于照射前记录的温度。温度逐渐下降-2.275±0.597°C，之后逐渐升高，并在190 s时记录到-1.725°C±0.359°C的变化。相反，在没有空气和水冷却的条件下，60 s的激光照射导致的温度变化为5.067°C±0.058°C（图5）。
在有和没有空气和水冷却的情况下，Er:YAG激光照射（0.5W，167J/cm 2）期间的髓腔内温度变化。
牙髓组织的形态学改变
HE染色后通过光学显微镜观察牙髓的形态学改变。两组之间没有观察到显著差异。成牙本质细胞和血管，以及胶原和神经纤维的形态均清晰健康（图6）。
在本体外研究中，参数为0.5 W，167 J/cm2（50 mJ，10 Hz）的Er:YAG激光在1级水雾冷却下能够实现有效的牙本质小管封闭，并且对牙髓无明显损伤，这为激光治疗牙本质过敏提供了理论依据。
Absi、Addy和Adams（1987）等的研究发现，患有DH的牙齿每表面积的开放DT数量是没有DH的牙齿的8倍，敏感牙齿的小管直径是不敏感牙齿的2倍。此外，有一项比较研究表明，SEM观察发现，35%的磷酸处理比24%的乙二胺四乙酸（EDTA）处理能产生更好的DT暴露。因此，在本研究中，牙本质样本（DS）首先经过35%磷酸处理1分钟，以暴露于DT、建立DH模型。对照组的SEM图像显示，牙本质表面清洁光滑，小管口无玷污层和栓塞；这与之前的研究结果一致。
Gluma脱敏剂由戊二醛和2-羟乙基甲基丙烯酸酯（HEMA）组成，可使牙本质液中的血清白蛋白凝结。戊二醛和白蛋白之间的这种反应诱导HEMA聚合。因此，脱敏剂可以形成类似于激光照射后形成的熔化层的凝固栓塞。根据其他几项研究，我们在本研究中使用了Gluma脱敏剂作为阳性对照。对于激光是否比Gluma脱敏剂更好地治疗DH，目前还缺乏共识。Lopes，Euardo e Aranha（2017）进行的一项为期18个月的随机临床研究表明，与Nd:YAG激光治疗组和Nd:YAG激光器+Gluma脱敏剂治疗组相比，Gluma脱敏剂治疗组的脱敏持续时间最长。然而，Ozlem等人（2018）使用酵母探针评估了Er:Cr:YSGG激光、Gluma脱敏剂或两者联合治疗的牙本质过敏症患者的牙本质敏感性，结果表明，即使在不同的时间间隔（7、90、180天），单独使用Er:Cr:YSGG激光治疗该疾病也能获得最理想的结果。考虑到Er:YAG激光的波长与Er:Cr:YS GG激光的波长接近，这两种激光在牙本质小管封闭中的作用原理相似。Er:Cr:YSGG激光的优异疗效为Er:YAG激光治疗DH的良好应用前景奠定了坚实的基础。
Er:YAG激光器是高功率激光器，我们在本研究中使用了0.5（低）至4 W的功率。根据表1，用于脱敏治疗的Er:YAG激光参数设置通常较低（输出功率范围在0.08W-3W之间）。关于冷却系统的应用，当输出功率较高（3W）时，激光处理时应该伴随水冷却，而当输出功率较低（0.08W）时则可以无水工作。考虑到本实验中使用的激光器的低内置参数设置为0.5W，我们将0.5W设置为参数探索的起始值，同时出于安全考虑，开启了水-空气冷却模式。激光治疗组的扫描电镜表现出显著差异。此外，在0.5W、167J/cm2的照射后，DT暴露率低，其SEM照片显示DT几乎完全被熔化层遮挡。尽管本研究中使用的参数与之前的研究中所使用的参数不同，本研究结果与之前探索Er:YAG激光DT封闭效应的研究结果仍然一致。Belal和Yassi（2014）使用SEM观察暴露DT周围的熔化区域，评估了Er:YAG激光对DT封闭的影响。Er:YAG激光组的小管封闭百分比明显高于其他组。此外，Badran等人（2011）研究发现，120秒的Er:YAG激光照射可使DT完全封闭，表现出褶皱、熔化的牙本质表面，没有可见的DT迹象。在Belal和Yassi（2014）的一项研究中，激光功率（40 mJ，10 Hz）略低于本研究，而照射距离较本研究短（该研究：轻微接触；本研究：30mm）。同样，Badran等人（2011）的一项研究中的参数设置为60 mJ，2 Hz（0.12 W），显著低于本研究中使用的0.5 W，但照射时间（60 s）是本研究30 s的两倍，并且没有水冷却，这明显增强了Er:YAG激光器的熔化效果。总之，Er:YAG激光器的热机械烧蚀作用可能是选择激光器应用参数的主要影响因素。照射表面的温度升高会导致牙本质组织融化和再结晶，导致小管口闭塞。
有趣的是，我们发现小管暴露率随着激光设备功率设置的增加而增加。与在0.5W、167J/cm2下处理的牙本质表面相比，在1W、334J/cm2下的处理表现出熔化，具有气泡状外观和一些部分闭塞的DT。这一发现与另一项研究的结果一致，这种现象可以归因于这样一个事实，即更高的功率设置可能导致快速的水分蒸发，而非DT闭塞；快速的水蒸发导致照射表面上发生微爆炸，从而引起这种形态变化。此外，在2W、668J/cm2下处理的牙本质和在4W、1336J/cm2下治疗的牙本质表现出相似的外观，但小管暴露率有显著差异（P<0.05）。我们推测，当激光功率超过烧蚀阈值时，类似的剥离表面是由表面硬组织的切割引起的。其他研究也显示了类似的结果。Harashima等人（2005）比较了Er:YAG激光器制备窝洞腔和Er，Cr:YSGG激光器制备窝洞的形态特征，发现两组具有相似的不规则切粗糙的表面，且DT开放DT。在2940 nm的波长下，水比硬组织能够更强烈地吸收Er:YAG激光的能量，导致微膨胀，微膨胀可以产生水动力，通过机械分离快速清除目标硬组织。
因此，基于SEM图像的结果，参数设置为0.5W、167J/cm2似乎适合于适当的DT封闭。然而，激光治疗的能量积累可能会对牙髓组织健康造成损害。研究表明，牙髓会对外部施加的热量产生反应。髓内温度升高5.5°C可能导致15%的牙髓坏死，而当温度升高11°C时，60%的牙髓可能发生牙髓坏死。
在本研究中，在水和空气冷却下，0.5 W、167 J/cm2的Er:YAG激光照射最初导致髓内温度下降（−2.275°C±0.597°C）。同样，Yaneva等人（2016）研究了使用Er:YAG激光器进行根面平整过程中髓室的温度变化，发现每10秒温度下降1.6°C、2.4°C、2.5°C和2.5°C。牙髓内温度的变化取决于以下因素：激光发射类型（脉冲或连续）、照射器和目标组织之间的距离、激光束的波长、照射过程中空气或水冷却的使用、照射的持续时间以及手柄的移动。由于设定波长的原因，Er：YAG激光具有高吸收率的特点，因而对硬组织和软组织的组织穿透性较小。因此，Er:YAG激光不太可能对组织造成不利的热影响。此外，激光束的脉冲发射可以在一定程度上允许在下一激光束照射之前被照射组织的温度进行归一化。此外，还不应忽视照射过程中连续水和空气冷却的重要性，这可以防止物理上髓腔内温度的明显升高。总的来说，上述所有因素都有助于空气和水冷却组的髓腔内温度降低。但是，温度仍会随时间逐渐升高，在190 s时记录到-1.725°C±0.359°C的变化。这表明照射持续时间也是影响牙髓安全性的重要因素。在先前的研究中，在空气和水冷却下，在Er:YAG激光照射下30 s内的髓腔内温度变化记录为-2.2°C±1.5°C。此外，随着照射时间的延长，髓腔内温度逐渐升高，这证实了本研究的结果.我们发现，在没有水和空气冷却的情况下，照射期间髓腔内温度升高，在30s时为1.833℃±0.473℃，在60s时为5.067℃±0.058℃，最终增加低于Zach和Cohen30（1965）报道的5.6°C的安全阈值。总的来说，虽然激光照射期间的水和空气冷却已被证明对牙髓安全性很重要，但本研究中的参数（0.5 W，167 J/cm2）即使没有冷却也具有高度安全性。
至于牙髓组织的形态学改变，根据HE染色的结果，在用0.5W（167J/cm2）处理后没有发现成牙本质细胞有显著的形态学改变。因此，0.5W（167J/cm2）的参数对于Er:YAG激光治疗DH是安全的。
综上，本研究为一项初步的体外研究，研究了使用Er:YAG激光成功治疗DH的合适参数。本研究在一定程度上可以为进一步的临床试验提供参考。考虑到Er:YAG激光能量的高吸水性，牙齿中的液体和牙髓中的血液循环可以减少温度的升高，从而提高实际临床试验中参数的安全性。但本研究也具有以下局限性：首先，样本量相对较小；其次，这是一项体外研究，因此还需要进行长期随访的临床试验，以观察在刷牙和酸性刺激等口腔内条件下的结果。第三，由于个体差异，即使在牙本质以下相同深度，也很难标准化牙本质DT数的变化。此外，牙髓对这种治疗的反应也需要深入研究，以进一步验证其实际安全性。
本研究结果表明，在1级喷水下，0.5W、167J/cm2的Er:YAG激光照射可以有效地封闭DT，而不会对牙髓产生任何不利的热影响。
本项工作得到了广东省科技厅（编号：2018B030311047）、广州市科技计划（编号：2018 04010419）和南方医科大学南方医院院长基金（编号：2017C005）的资助。
作者感谢中国科学院广州能源转换研究所对SEM分析的帮助。感谢Editage[www.Editage.cn]的英语编辑。
作者声明作者声明没有财务利益冲突。
庄泓敏：研究思路（领导）；数据管理（领导）；形式分析（领导）；研究（牵头）；实验方法（参与）；资源（领导）；验证（领导）；可视化（领导）；写作：初稿（领导）。梁悦娥：研究思路（参与）；形式分析（参与）；方法论（参与）；项目管理（参与）；资源（参与）；写作：检查和编辑（参与）。向绍雯：写作：检查和编辑（参与）。李焕影：数据管理（参与）。戴杏竹：形式分析（参与）。赵望泓：研究思路（参与）；写作：检查和编辑（参与）。
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